Cut-tag-seq

服务简介

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation，靶向切割与标记）是一种全新的染色质蛋白-DNA相互作用研究技术。该技术利用抗体引导的Tn5转座酶（Protein A/G-Tn5融合蛋白）特异性结合靶蛋白（如转录因子、组蛋白修饰），在原位实现抗体靶向区域的DNA片段化与接头插入，通过高通量测序获得全基因组范围内的结合位点信息。

与传统ChIP-seq相比，CUT&Tag无需甲醛交联、超声打断和免疫沉淀，操作简便、信噪比高、重复性好，且所需细胞量极少，已成为表观基因组学研究的重要工具。

我们提供从细胞/组织样本处理、CUT&Tag建库、高通量测序到生物信息学分析的一站式服务，助力转录因子结合位点、组蛋白修饰、染色质调控元件的高精度定位。

技术原理

1、CUT&Tag的核心是利用Protein A/G-Tn5融合蛋白（pA/G-Tn5）实现抗体靶向区域的DNA片段化与标记：

2、细胞透化与抗体结合：将细胞固定在伴刀豆蛋白A（ConA）磁珠上，透化细胞膜，加入特异性一抗（针对目标蛋白，如H3K4me3、H3K27ac、CTCF等），抗体结合靶蛋白。

3、pA/G-Tn5结合：加入Protein A/G-Tn5融合蛋白，其与抗体Fc段特异性结合，从而将Tn5转座酶锚定在靶蛋白结合的染色质区域。

4、转座反应：加入Mg²⁺激活Tn5转座酶，在抗体靶向的染色质区域进行DNA片段化，同时插入测序接头。

5、DNA提取与文库扩增：终止反应，提取DNA片段，通过PCR扩增引入index，构建测序文库。

6、高通量测序：使用Illumina平台进行双端测序（PE50或PE75）。

7、数据分析：将reads比对到参考基因组，识别富集峰（peak），注释靶蛋白结合位点，进行差异分析及下游功能解析。

与ChIP-seq相比，CUT&Tag在信噪比、重复性、起始细胞量方面均有显著优势。

技术优势

核心优势总结：

✅ 超低起始量：可处理500-100,000个细胞，适用于稀有细胞、分选细胞、临床活检样本

✅ 高信噪比：无需交联和超声，背景极低，富集效果优于ChIP-seq

✅ 简便快速：从细胞到文库仅需2天，实验流程标准化

✅ 高重复性：减少人为操作步骤，批次间差异小

✅ 抗体用量少：每个反应仅需0.5-2 μg抗体，节约宝贵抗体

✅ 可拓展性强：支持单细胞CUT&Tag、组织CUT&Tag（不分离细胞）

四、实验流程

1、样本准备

①细胞样本：贴壁细胞消化后计数，悬浮细胞直接离心收集。推荐细胞数：500-100,000个/反应。

②组织样本：新鲜组织解离成单细胞悬液，或直接使用冷冻组织进行细胞核提取后实验。

2、细胞固定与磁珠结合

①使用ConA磁珠结合细胞，磁分离去除上清。

②加入抗体孵育缓冲液，透化细胞膜，加入一抗（针对目标蛋白），4℃孵育过夜或室温2小时。

③磁立架分离洗涤，去除未结合抗体。

3、pA/G-Tn5结合与转座

①加入Protein A/G-Tn5融合蛋白，室温孵育1小时，使Tn5结合至抗体。

②磁立架分离洗涤，去除未结合的pA/G-Tn5。

③加入含Mg²⁺的转座缓冲液，37℃孵育1小时，激活Tn5进行DNA片段化及接头插入。加入SDS或EDTA终止反应。

4、DNA提取与文库扩增

①加入蛋白酶K消化蛋白质，释放DNA片段。

②纯化回收DNA。

③使用与插入接头互补的引物进行PCR扩增（通常12-18个循环），引入index和测序必需序列。

④文库片段筛选（通常选择200-600 bp范围）。

⑤文库质控（Qubit定量、Agilent 2100片段分析）。

5、高通量测序

测序平台：Illumina NovaSeq 6000 / HiSeq X Ten / NextSeq 2000

6、生物信息学分析（标准分析；高级分析需定制）

应用领域

1、组蛋白修饰谱绘制：H3K4me3（活性启动子）、H3K27ac（活性增强子）、H3K4me1（增强子）、H3K27me3（抑制性标记）、H3K36me3（转录延伸）等。

2、转录因子结合位点定位：如CTCF、p53、MYC、FOXO1、STAT3等。

3、染色质调控元件鉴定：启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件。

4、表观遗传疾病机制研究：比较疾病与正常样本的组蛋白修饰差异。

5、药物机制研究：评估药物对染色质状态的影响。

6、稀有样本表观分析：临床活检、FACS分选细胞、胚胎细胞等。

样本要求

提示：

1、CUT&Tag通常不需要甲醛交联，过度固定会降低抗体可及性。建议使用新鲜或快速冷冻样本。

2、对于组织样本，建议先进行细胞核提取，以提高数据质量。

3、抗体必须经过验证（WB或ChIP验证），且推荐使用无BSA、无叠氮钠的抗体储存液。

交付内容

1、原始测序数据：FASTQ格式文件（云下载链接）

2、质控报告：测序质量、比对率、重复率、peak数量、FRiP、TSS富集得分等

3、peak检测结果：peak区域的BED文件和bigWig轨迹文件（可导入IGV查看）

4、peak注释结果：peak在基因组各功能区域的分布（启动子、内含子、基因间区等）

5、差异peak分析：差异peak列表（log2FC、p值、FDR）、火山图、聚类热图

6、motif富集分析：显著富集的转录因子结合基序及对应的转录因子列表

可视化图片：

7、peak热图（样本间相关性）

8、差异peak的GO/KEGG功能富集图

9、高级分析结果（如选做）：超级增强子鉴定、足迹分析、与RNA-seq关联分析图

10、完整实验报告：详细流程、抗体信息、试剂批次、仪器参数、分析脚本

实验结果示例

参考文献

1、Glycolysis-Derived Lactate Induces ACSL4 Expression and Lactylation to Activate Ferroptosis during Intervertebral Disc Degeneration

2、YY1 Lactylation Aggravates Autoimmune Uveitis by Enhancing Microglial Functions via Inflammatory Genes

3、Histone lactylation- driven feedback loop modulates cholesterol- linked immunosuppression in pancreatic  cancer

常见问题

Q1：CUT&Tag与ChIP-seq如何选择？
CUT&Tag在信噪比、起始细胞量、重复性、实验周期方面均优于ChIP-seq。对于常规样本（≥10⁵细胞），两者均可；对于稀有样本（<10⁵细胞）、需要高信噪比或快速出结果的项目，强烈推荐CUT&Tag。

Q2：CUT&Tag需要多少起始细胞？
组蛋白修饰（如H3K4me3、H3K27ac）通常需要1000-10,000个细胞即可获得良好数据；转录因子（如CTCF）可能需要10,000-50,000个细胞。

Q3：CUT&Tag能否用于组织样本？
可以。组织样本需先解离成单细胞悬液或提取细胞核。

Q4：客户需要提供抗体吗？
客户可提供已验证的一抗（建议无BSA、无叠氮钠），也可委托我们代购。

Q5：CUT&Tag的数据质量如何评估？
关键指标包括：比对率（>70%）、peak数量（组蛋白修饰通常数千至数万，转录因子数百至数千）、FRiP（>0.5%为良好）、TSS富集得分（组蛋白修饰通常>10）。我们提供详细质控报告。

Q6：能否与RNA-seq数据关联分析？
可以。我们提供整合分析服务，将CUT&Tag的peak数据与RNA-seq表达数据关联，揭示表观修饰与基因表达的调控关系。