磷酸化蛋白鉴定

服务简介

蛋白质磷酸化是最重要、最普遍的翻译后修饰之一，调控细胞信号转导、增殖、分化、凋亡等几乎所有生命活动。异常磷酸化与肿瘤、神经退行性疾病、代谢性疾病等密切相关。磷酸化修饰蛋白质组学通过特异性富集磷酸化肽段，结合高分辨质谱技术，对生物样本中的磷酸化位点进行全面鉴定和精确定量，揭示磷酸化修饰的动态变化及其调控网络。

我们提供基于TiO2（二氧化钛）、IMAC（固定化金属亲和层析）富集策略，配合TMT/4D-DIA/非标记定量 等多种定量方法的磷酸化蛋白质组学服务，支持细胞、组织、体液、外泌体等多种样本类型，助力信号通路解析、药物靶点发现及生物标志物筛选。

技术原理

1、磷酸化肽段富集

磷酸化肽段在总肽段中丰度极低（<1%），必须进行高效富集。两种主流方法：

通常采用TiO2法或TiO2+IMAC串联，最大限度提高磷酸化肽段覆盖率。

2、质谱检测与定量

定性：LC-MS/MS，HCD碎裂，检测中性丢失磷酸（-98Da）特征峰。

定量：

①非标记定量（LFQ）：适合少样本（≤10），无需标记，成本低。

②TMT标记定量：适合多分组（6-18组），精度高，缺失值少。

③4D-DIA定量：深度覆盖，低丰度磷酸化位点，适合大队列。

3、磷酸化位点定位

使用专业软件进行数据库搜索，结合磷酸化定位概率计算，确保位点准确。

技术优势

✅ 高效富集：TiO2+IMAC串联策略，磷酸化肽段富集倍数>50倍。

✅ 深覆盖：4D-DIA平台可鉴定20000+磷酸化位点（细胞/组织）。

✅ 精确定量：TMT定量批次内CV<10%，适合多组比较。

✅ 位点可信度高：定位概率>0.75（Class I），假阳性率<1%。

✅ 完整生信分析：激酶-底物预测、信号通路富集、Motif分析等。

实验流程

1、蛋白提取：加入磷酸酶抑制剂，防止脱磷酸化。

2、蛋白酶解：胰蛋白酶酶解成肽段混合物。

3、磷酸化富集：TiO2或IMAC色谱柱富集磷酸化肽段，洗脱、除盐。

4、质谱检测：LC-MS/MS（DDA 或 DIA 模式），HCD碎裂。

5、数据分析：数据库搜索、磷酸化位点定位（phosphoRS）、定量分析（LFQ / TMT / DIA）。

6、生物信息学：激酶-底物网络、Motif分析、通路富集等。

7、交付：位点列表、定量矩阵、生信图表、原始数据。

应用领域

1、细胞信号转导机制：研究生长因子、激素、细胞因子等刺激下的磷酸化动态变化。

2、肿瘤发生发展：鉴定肿瘤驱动性磷酸化事件，发现治疗靶点（如激酶抑制剂）。

3、药物作用机制：分析药物处理后的磷酸化网络变化，揭示靶点及耐药机制。

4、神经退行性疾病：Tau、α-synuclein等磷酸化异常在AD、PD中的角色。

5、免疫调控：T细胞激活、炎症通路中的磷酸化级联反应。

6、激酶抑制剂筛选：评估化合物对激酶-底物磷酸化的影响。

样本要求

注意：

1、磷酸化修饰极易在样本处理过程中变化，请务必：新鲜样本或液氮速冻，避免反复冻融。

2、裂解液必须包含新鲜配制的磷酸酶抑制剂。

3、全程冰上操作，防止脱磷酸化。

实验结果示例

参考文献

1、Deciphering a profiling based on multiple post-translational modifications functionally associated regulatory patterns and therapeutic opportunities in human hepatocellular carcinoma

2、Multi-omics profiling reveals rhythmic liver function shaped by meal timing