RNA pull down

实验原理

RNA pull-down是一种研究RNA与蛋白质相互作用的体外实验技术。

基本原理是：将体外转录的、带有标记（如生物素）的目标RNA（或RNA片段）与细胞裂解液共孵育。RNA与裂解液中的蛋白质相互作用形成RNA-蛋白复合物。利用标记物（如链霉亲和素磁珠）将RNA-蛋白复合物从溶液中捕获并分离。经过洗涤去除未结合的蛋白质后，通过Western Blot检测特定蛋白是否与目标RNA结合，或通过质谱（MS）鉴定与目标RNA结合的所有蛋白质。

该技术常用于验证RNA结合蛋白与特定RNA之间的相互作用，以及发现新的RNA相互作用蛋白。

（RNA pull down实验原理图）

服务流程

客户咨询——方案/实验材料确认——探针制备/合成——生物素标记——蛋白裂解孵育——Pull-down实验——WB/银染-质谱检测——项目报告

实验流程

服务内容及说明

适用场景

1、RNA-蛋白互作鉴定：鉴定与特定RNA（mRNA、circRNA、lncRNA、miRNA）相互作用的蛋白。

2、非编码RNA机制研究：探索lncRNA、circRNA通过结合蛋白发挥功能的机制。

3、疾病标志物：筛选与疾病相关RNA结合的关键蛋白。

实验周期

RNA pull down实验 * 结果示例

 实验步骤

1. 生物素标记RNA探针制备

①通过体外转录合成目标RNA序列，并使用生物素标记的核苷酸（如Biotin-UTP）进行标记。或通过化学合成方式直接合成生物素标记的RNA探针。

②纯化RNA探针，检测其完整性和浓度。同时制备阴性对照RNA探针（如非特异性RNA序列）。

2. 细胞裂解液制备

①收集细胞，用预冷的PBS洗涤1次。

②加入适量裂解缓冲液（含RNase抑制剂和蛋白酶抑制剂），冰上裂解15-30分钟。

③4℃离心（12000×g，10分钟），取上清进行蛋白定量，调整至相同浓度。

3. RNA-蛋白结合

①将生物素标记的RNA探针与细胞裂解液混合，加入RNase抑制剂。

②4℃旋转孵育2-4小时或过夜，使RNA与蛋白充分结合。

4. 磁珠捕获

①取适量链霉亲和素磁珠，用洗涤缓冲液平衡2次。

②将RNA-蛋白结合混合物与磁珠混合，4℃旋转孵育1-2小时。

③将离心管置于磁力架上，弃去上清。

5. 洗涤与洗脱

①用洗涤缓冲液洗涤磁珠3-5次，每次洗涤后充分去除上清，以降低非特异性背景。

②加入洗脱缓冲液，95℃加热5-10分钟，或使用游离生物素竞争性洗脱，收集洗脱液。

参考文献

1、CircAKT3 promotes prostate cancer proliferation and metastasis by enhancing the binding of RPS27A and RPL11

2、SNORA49 negatively regulates self-renewal of liver cancer stem cells and hepatocarcinogenesis via suppressing SOX9 transcription

3、Exosome-derived circCCAR1 promotes CD8 + T-cell dysfunction and anti-PD1 resistance in hepatocellular carcinoma