Tycontra DNA Assembly Mix

【产品简介】

◇Tycontra DNA Assembly Mix是基于同源重组原理开发的一款简单、快速、高效的无缝克隆试剂盒 ，能够将任意含有载体末端重叠区域的DNA片段重组至线性化载体上 ，不受酶切位点限制 ，载体自连背景极低。该方法的实现需要在插入片段正/反向 PCR 引物的 5’端引入线性化载体上的15~25 nt 末端序列，通过重组酶的作用使得具有重叠区域的片段和载体最快在50℃ 5 min内重组，完成无缝克隆。 

◇本产品可同时实现 1~3 个DNA片段的重组。 

【货       号】   P1572

【规      格】  50T（10ul体系）

【包装清单】  

【保存条件】   -20ºC保存，有效期一年。避免反复冻融。

【使用说明】 

1、线性化载体的制备

选择合适的克隆区域对载体进行线性化（尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域），线性化的方法有酶切制备和反向PCR扩增制备两种。

1）酶切制备推荐使用双酶切使载体线性化更完全，以降低转化背景。使用单酶切线性化载体时，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。平末端或粘末端均可 ，但务必保证酶切完全（可用琼脂糖电泳验证观察）。

2）反向PCR扩增制备推荐使用高保真聚合酶（如NEB的Q5、TOYOBO的KOD或Pfu等）扩增减少碱基突变的概率。推荐使用预线性化质粒为模板,以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。当模板为环状质粒时，扩增产物建议用DpnI消化后使用。

2、插入片段的制备

1）引物设计原则插入片段扩增引物由两部分构成：重叠区域+特异性引物，即在插入片段的正/反向引物的5’端引入待重组的线性化载体末端15~25nt的序列（建议同源部分长度≥18nt）。

2）PCR 扩增制备推荐使用高保真聚合酶（如NEB的Q5、TOYOBO的KOD或Pfu等）扩增减少碱基突变的概率。扩增后使得插入片段末端带有和线性化载体末端一致的同源序列。

3、重组反应（推荐/10ul体系）

①pUC19 Control Plasmid Linearized(Amp,40ng/ul)

②Control Fragment(500bp,20ng/ul)

a:最适载体用量(ng)=0.02×载体碱基对数 ，即 0.03pmol；

b：最适片段用量(ng) = 0.04×片段碱基对数，插入多片段，每片段最适用量（ng）=0.02×片段碱基对数。若插入单片段的长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量;若插入片段的长度小于 200bp,则插入片段应使用 5 倍载体用量；

c:检验线性化载体中有无背景质粒残留；

d:当插入片段扩增模板是与克隆载体抗性相同的环状质粒时 ,推荐进行；

e:用来排除其他操作因素的影响。

2) 反应条件将上述各个成分轻柔混匀(避免产生气泡 ,请勿涡旋操作)按如下条件进行反应：

注：当载体骨架>10kb 或插入片段>4kb 时 ，建议延长反应时间至 30~60min。

3)转化验证（参照所用感受态的使用说明）

A、取 100ul 感受态细胞于冰浴上融化，加入适量重组产物（体积不超过所用感受态细胞体积的 1/10）轻轻混匀，冰上静置 30min；

B、42℃水浴热激 60s ,迅速转移至冰浴中,静置 2min；

C、向离心管中加入 500ul 不含抗生素的无菌培养基（2×YT 或 LB）混匀后 37℃200rpm 复苏 1h；

D、根据实验需要,吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含相应抗生素的 2×YT 或LB 培养基上，将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养。

4）阳性克隆的鉴定（根据具体实验要求选用合适的方法，建议做双重验证）

A、菌落/菌液 PCR 鉴定：用枪头挑取单菌落至 10ul 无菌水中混匀后取 1ul 为模板，或直接蘸取菌落至 PCR 体系中扩增（建议至少使用一条通用引物以避免假阳性结果）；

B、以质粒为模板 PCR 鉴定：挑取单克隆至含相应抗生素的 LB 培养基中 37℃ ,200rpm 过夜摇菌后抽提质粒作为模板，可使用载体通用引物或特异性引物扩增；

C、酶切鉴定：挑取单克隆至含相应抗生素的 LB 培养基 37℃，200rpm 过夜摇菌后抽提质粒 ,使用相应内切酶酶切质粒后电泳检测片段大小；

D、测序：建议使用载体通用引物测序鉴定。

【注意事项】

1.经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化 ，单酶切则需要去磷酸化；

2.酶切完成后，应快速将内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应；

3.若载体为粘性末端，且 3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；

4.若 5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含；

5.尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游 25nt 区域内 GC 含量为 40% ~60%时 ，重组效率最高；

6.计算扩增引物 Tm 值时，只需计算特异性引物的 Tm 值，引入的额外序列无需计算。

7.若载体片段过长、插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低，此时建议分步进行无缝克隆；

8.若某一组分浓度过高可适当稀释，每个组分的用量最好不低于 1ul；

9.推荐使用 PCR 仪等温控较精准的仪器反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；

10.50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底，减少产物损失；

11.进行重组后的产物，建议即时转化，避免贮存导致克隆阳性率下降。