Nature Genetics | PROX1：守护肝细胞的 “忠诚卫士”，竟能左右肝癌命运？

细胞命运可塑性在发育中受限，异常激活会引发疾病甚至癌症。转录因子对其有重要调控作用，虽已知转录激活因子可诱导细胞特异性，但转录抑制因子在维持细胞命运方面的作用，尤其是“保护抑制因子”的普遍性和功能，尚不明确。

预测并验证“保护抑制因子”

为了鉴定保护抑制因子，我们定义了以下三个特征：（1）细胞类型特异性和终生表达；（2）结合并抑制替代命运基因；（3）促进和维持细胞身份。我们聚焦于所有胚层的18种细胞类型，并使用Tabula Muris数据来定义1296个检测到的转录因子的细胞类型特异性基因特征和表达特异性。我们期望保护因子候选物能够结合替代命运基因，并整合细胞类型特异性表达和特征基因上的DNA结合基序消耗，从而得出保护抑制因子评分（图1a、扩展数据图1和补充表1）。该分析的可搜索数据库可访问https://apps.embl.de/safeguard/。

我们筛选出了59个候选物，其中50个具有已报道的抑制因子或双重激活/抑制因子功能（图1b和补充表2）。总共有33个在2岁小鼠中持续表达，77%（17/22）的心脏、大脑和肝脏候选物在整个发育过程中高表达（图1b）。总体而言，27个候选物满足我们对终生保护抑制因子的标准，14个被报道可促进预测的细胞命运，包括神经元保护因子MYT1L（图1b和扩展数据图1d-f）。排名靠前的肝细胞候选物PROX1表现出肝细胞特异性表达，并基于基序富集和核酸酶切割及释放（CUT&RUN）结合，与许多非肝细胞基因结合（图1c、d、扩展数据图1g和补充表3）。有趣的是，据报道，59%（16/27）的候选物在其各自的细胞类型中具有肿瘤抑制作用（图1b）。

图 1

PROX1抑制肝癌发生发展

接下来，我们分析了肝癌小鼠模型的单细胞RNA测序数据中的Prox1表达。我们发现，与肝细胞相比，转化细胞中的Prox1水平较低，这与肝细胞特性的降低相符（图2g）。为了研究操纵PROX1是否能预防肝癌形成，我们使用了一种肝癌小鼠模型，该模型通过流体动力尾静脉注射（HDTVI）将Myc过表达和Trp53基因敲除（Myc/Trp53）相结合（图2h、扩展数据图3a、b和补充表6）。2周后，小鼠发展出类似于肝癌的肿瘤，表达肝细胞核因子-4α（HNF4α），但缺乏胆管癌（CCA）典型的腺结构和角蛋白19（KRT19）表达。Prox1-IRES-GFP的组成型过表达在终点时导致肿瘤结节减少（6.7个对39.5个），并且所有产生的肿瘤都是GFP阴性，表明选择了对Prox1过表达的排斥（图2i和扩展数据图3c、d）。事实上，Prox1过表达将中位生存期从29天延长到64天，有几只小鼠在100天的实验中存活下来（图2j和扩展数据图3l）。我们发现，只有高水平的PROX1（由EF1a启动子驱动）才能显著延长生存期（扩展数据图3j-l）。

我们将相同的模型与可诱导的Prox1过表达相结合，以测试在HDTVI后14天肿瘤结节形成后的效果（扩展数据图3e）。在给予多西环素治疗两天后，通过CASP3组织学检测，我们观察到肿瘤中的凋亡增加了四倍多（扩展数据图3f、g）。RNA测序证实了凋亡的上调和促增殖MYC信号的下调，这与Hep3B细胞中的发现相似（扩展数据图2h和补充表7）。值得注意的是，晚期Prox1过表达在终点时减少了GFP+肿瘤结节（219.5个对13.75个），并将中位生存期从17天显著延长到36.5天（图2j和扩展数据图3h、i），这表明PROX1阻断了肿瘤的进展。为了确定PROX1是否抑制不同遗传病因的癌症，我们使用了第二种小鼠模型，该模型由HDTVI介导的Kras(G12D)过表达和Trp53基因敲除（Kras/Trp53；扩展数据图3m）诱导。该模型同时出现了肝癌和CCA特征，肿瘤形态复杂，HNF4α水平较低，KRT19染色较高（扩展数据图3n）。在这里，Prox1过表达也减少了肿瘤结节的数量（3.25个对19.5个），所有肿瘤都缺乏Prox1-IRES-GFP，并将生存期从26.5天延长到47.5天（图2k-m和扩展数据图4o、p）。这表明PROX1通过阻碍不同肝癌小鼠模型中的肿瘤起始和进展发挥肿瘤抑制作用。

图 2

图 3

PROX1对肝脏再生和重编程至关重要

细胞命运可塑性在其他命运转变中起着关键作用，如损伤后的再生或直接的细胞重编程。肝脏损伤后，成熟的肝细胞可以通过重新激活祖细胞样程序去分化，随后肝细胞增殖和再生。使用单细胞RNA测序数据，我们发现，在3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢柯利定（DDC）诱导的损伤后，Prox1表达和肝细胞特性急剧下降，并在再生过程中恢复（图3a、b）。因此，我们用DDC处理条件性Prox1基因敲除小鼠，发现Cre介导的纯合Prox1-/-缺失导致HNF4+肝细胞的数量和密度减少约33%，而胆管细胞（KRT19+）的百分比在再生后增加（图3c、d和扩展数据图4a-c）。恢复后，Prox1缺失小鼠的肝脏损伤标志物碱性磷酸酶（ALP）血清水平升高了两倍，而其他标志物升高但未达到统计学意义（图3e和扩展数据图4d），这表明PROX1是损伤后有效肝细胞再生所必需的。

为了研究PROX1如何增强肝细胞命运，我们使用单细胞RNA测序在第2、7和14天评估了Prox1在MEF的4-in-1诱导的肝细胞重编程期间的作用（图4a和补充图2a-d）。过表达Prox1的细胞主要构成了与实验时间点相对应的不同簇（图4b、c）。我们对每个细胞的细胞类型特异性基因特征进行评分，发现了一个MEF样簇和一个肝细胞样簇（图4d）。Prox1过表达增加了肝细胞特性，成功重编程的肝细胞数量增加了七倍以上。这些细胞还更有效地下调了MEF命运，并显示出较少的替代细胞身份（图4e和补充图2e-i）。相应地，根据在MEF中ProX1 CUT&RUN数据定义的PROX1调控组的活性与成纤维细胞身份特征呈负相关，这表明PROX1直接抑制MEF基因（图4f、补充图1e和补充表8）。有趣的是，虽然肝脏诱导剂（4-in-1）的调控组活性与肝细胞和替代细胞身份（如胆管细胞）呈正相关，但PROX1的活性与除肝细胞和少突胶质细胞特征外的所有测试细胞身份呈负相关（图4f）。这表明PROX1可以直接抑制可能由4-in-1激活的非肝基因特征，以促进所需的肝细胞命运。

图 4

PROX1抑制替代命运

我们接下来测试了PROX1过表达对神经元和肌细胞重编程的影响。通过神经元（TUBB3）和肌细胞（结蛋白）标记蛋白表达测定，两者在Prox1过表达时几乎都被完全阻断（图4g、h和补充图3（补充图3a-c和4a的Western印迹和凝胶在源数据部分提供））。有趣的是，虽然单独的MYOD1不会诱导任何肝样细胞，但在Prox1共表达时，18%的MYOD1重编程细胞表达TJP1（补充图3f）。MYT1L具有相似的作用，抑制肌细胞和肝细胞重编程，同时促进神经元转化（补充图3）。这表明像PROX1和MYT1L这样的保护抑制因子促进特定的细胞命运，并可能重定向由神经元和肌肉主调节因子诱导的细胞命运。

由于Prox1过表达足以抑制替代命运，我们确定了内源性Prox1表达是否是肝细胞重编程所必需的。在shRNA介导的Prox1敲低后，白蛋白分泌、TJP1免疫荧光和肝细胞基因表达表明肝脏重编程受损（扩展数据图5）。类似地，条件性Prox1缺失导致TJP1阳性肝细胞样细胞减少超过七倍，每个细胞的白蛋白分泌降低（图4i-k和扩展数据图5d）。值得注意的是，在肝脏重编程期间，表达结蛋白的细胞比例在Prox1缺失时增加（图4l和扩展数据图5e）。RNA测序证实，基因Prox1缺失在肝细胞重编程期间降低了肝脏标志物的表达，并增加了神经元Map2和肌细胞Myh9等替代命运标志物的水平（扩展数据图5f），这表明PROX1通过抑制替代命运来有效诱导肝细胞命运是充分和必要的。

图 5

PROX1调控肝癌可塑性

细胞可塑性在肝癌中起着关键作用，也就是说，胆管癌（CCA）和肝细胞癌（HCC）都可以由肝细胞发展而来。然而，调节肝细胞向HCC或CCA转化的因素在很大程度上是未知的。值得注意的是，PROX1在HCC中的表达比在CCA中高1.4倍，并且HCC患者中高表达PROX1的生存期比CCA患者更好（图7a和扩展数据图9a）。有趣的是，CCA标志物KRT19以及PROX1的靶标PRRX1和PPARG与肿瘤组织中的PROX1表达呈负相关（图7b），这表明PROX1可以调节肝癌的可塑性以及HCC与CCA的命运。因此，我们在Myc/Trp53 HCC小鼠模型中进行了CRISPR介导的Prox1基因敲除。这导致肿瘤数量增加了两倍多，中位生存期缩短了约10天（扩展数据图9b-d）。为了追踪受干扰的细胞，我们使用与GFP报告基因相连的shRNA构建体进行Prox1敲低。这导致2周后肿瘤结节数量增加了十倍，而肿瘤数量和生存期在终点没有受到影响（扩展数据图9e-i）。值得注意的是，Prox1敲低导致HCC向CCA转变，形成表达KRT19的腺泡肿瘤结构，并降低了HNF4水平（图7c，d）。

为了测试PROX1过表达是否对CCA有影响，我们在小鼠中进行了HDTVI介导的Akt和Notch1受体胞内结构域（NICD；Akt/Notch）过表达实验。2-3周后，这些小鼠发展出多灶性肝癌，具有腺泡结构、高KRT19水平和低HNF4α表达（图7c和扩展数据图10a，b）。持续的Prox1过表达在终点减少了肿瘤结节（59.8个对比245.2个），并将生存期从54天延长到88天（扩展数据图10c-f）。值得注意的是，Prox1过表达诱导了CCA向HCC的转变，腺泡结构减少，KRT19表达降低，HNF4水平升高（图7c，d）。在HDTVI介导的肿瘤形成21天后诱导Prox1过表达，也减少了腺泡结构并降低了胆管细胞标志物（KRT19和SOX9）的表达（扩展数据图10g-j）。CCA（Akt/Notch）和HCC（Myc/Trp53）小鼠的转录组分析证实了这些转变-Prox1在HCC中的敲低导致肝细胞标志物（如白蛋白和转甲状腺素蛋白）下调，以及胆管细胞标志物（如Krt19和Sox9）上调，而Prox1在CCA中的晚期过表达则产生相反的效果（图7e）。与人类肝癌样本中PROX1表达的差异一致，在小鼠肝癌模型中操纵PROX1可以改变肝细胞在CCA和HCC之间的转化轨迹。这表明PROX1可以在体内维持肝细胞的身份并预防肝脏疾病，较低水平的PROX1允许可塑性，而较高水平的PROX1减少转化和转分化。

图 6

图 7

PROX1作为肝细胞“保护抑制因子”，通过抑制非肝细胞基因维持肝细胞特性，在肝脏发育、再生和肿瘤抑制中起关键作用，为研究细胞命运调控和肝癌防治提供了理论依据，有助于开发相关治疗策略 。